一种香蕉幼根原生质体的解离方法

1、一种香蕉幼根原生质体的解离方法，其特征在于，所述解离方法包括如下步骤：   

步骤一，采用组织培养技术获得香蕉组培苗，消毒清洗后切取香蕉幼根组织获得制备原生质体的实验材料；

步骤二，加入少量原生质体缓冲液使实验材料保持湿润，原生质体缓冲液包括KCl 100 mM、MgCl2·6H2O 20 mM、CaCl2 20 mM、甘露醇0.6 M以及2-N-吗啉乙磺酸80 mM，溶剂为无菌水，pH值为5.5～5.8，然后用刀片将香蕉幼根组织快速切成薄片，吸去所述原生质体缓冲液后加入酶解液，酶解液的配制为将纤维素酶、离析酶、崩溃酶和BSA溶于原生质体缓冲液，按成分重量g：溶液体积mL计，所述纤维素酶、离析酶、崩溃酶和BSA的重量分别占到酶解液总体积的2%、0.5%、0.05%和0.1%；pH值为5.5～5.8，避光匀速摇晃酶解1～3小时；

步骤三，采用细胞过滤器将步骤二所得的酶解液和原生质体混合液进行过滤，向滤液中加入原生质体缓冲液清洗，低温低速离心后去上清；

步骤四，加入原生质体缓冲液重新悬浮沉淀，用细胞过滤器再次过滤，低温低速离心后去上清；

步骤五，再次加入原生质体缓冲液重悬原生质体。

2、根据权利要求1所述的解离方法，其特征在于，所述步骤一中，香蕉组培苗为萌芽14天后的组培苗；

消毒为用2%次氯酸钠消毒15 min；

消毒清洗后切取的幼根组织为从根尖起1 cm处切取的幼根组织。

3、根据权利要求1所述的解离方法，其特征在于，所述步骤二中原生质体缓冲液的配制过程：称取0.75 g KCl、0.19 g MgCl2·6H2O、0.22 g CaCl2、0.22 g甘露醇以及1.76 g 2-N-吗啉乙磺酸溶于无菌水中，0.1 M Tris-HCl调整pH值为5.5～5.8，并以无菌水定容至100 mL，最后采用0.22 µm的微孔滤膜过滤灭菌。

4、根据权利要求1所述的解离方法，其特征在于，所述步骤二中酶解液的配制为将纤维素酶、离析酶、崩溃酶和BSA溶于原生质体缓冲液，待酶完全溶解后，采用0.1 M Tris-HCl调整pH值，以原生质体缓冲液定容至所需体积；酶解液采用0.22 µm的微孔滤膜过滤灭菌。

5、根据权利要求1或4所述的酶解液，其特征在于，所述纤维素酶为纤维素酶R-10，所述离析酶为离析酶R-10。

6、根据权利要求1所述的解离方法，其特征在于，所述步骤二中将香蕉幼根组织快速切成0.9-1.1mm薄片；酶解反应条件包括反应温度为28～30℃，黑暗条件下将样品置于60～100 rpm/min的水平摇床上酶解。

7、根据权利要求1所述的解离方法，其特征在于，所述步骤三中将步骤二获得的酶解液和原生质体混合液经70 μm细胞过滤器过滤，向滤液中加入原生质体缓冲液清洗，于4～8℃条件下以300～500 ×g离心力离心5～10 min后去上清。

8、根据权利要求1所述的解离方法，其特征在于，所述步骤四中，往步骤三获得的原生质体加入原生质体缓冲液重新悬浮沉淀，采用40 μm的细胞过滤器再次过滤，于4～8℃条件下以300～500 ×g离心力离心5～10 min后去上清获得原生质体沉淀。

9、根据权利要求1所述的解离方法，其特征在于，所述步骤五在重悬原生质体后，用FDA染色后用荧光倒置显微镜和血球计数板检测原生质体浓度和活率；染色时，FDA在混合液中的终浓度为100 μg/mL，黑暗条件下室温染色5～30 min。

一种香蕉幼根原生质体的解离方法

技术领域

本发明属于植物细胞原生质体分离技术领域，具体涉及一种分离香蕉幼根原生质体的方法。

 

背景技术

香蕉是世界上最重要的水果之一，在热带和亚热带地区广泛种植，其种植面积和产量仅次于柑桔类，是世界第二大水果；鲜果消费量和贸易量均居全球水果之冠，是引起世界贸易战的少数水果之一。同时香蕉也是我国华南地区非常重要的经济果树之一，甚至是部分地区的主要经济支柱产业。目前，香蕉产业正面临枯萎病等重要病虫害的严重威胁，对其进行遗传改良一直备受研究人员的关注。通过探究香蕉根细胞的发育轨迹及胁迫响应的分子机制，可以为香蕉抗病等遗传改良研究提供基因资源。

随着生命科学测序技术的发展，可以从单个细胞水平解析基因表达、DNA甲基化等信息的单细胞测序技术悄然兴起。该技术可以深入分析不同类型细胞的特性及其相互联系，能够解答传统测序技术掩盖了的组织或器官中细胞之间的异质性问题。目前单细胞测序在人类及动物细胞的研究中已得到广泛应用；在植物细胞中则受细胞壁难以解离等因素的限制，需要解离为原生质体才能开展单细胞测序，因而应用相对缓慢。

原生质体是指采用一定方法去除细胞壁后的裸露植物细胞。目前研究香蕉原生质体制备方法的报道少见，且现有制备原生质体的方法多集中于利用愈伤组织或是悬浮细胞为材料（非完整植株，不利于胁迫实验的进行），制备出的原生质体也多用于遗传转化、植株再生等研究，其质量和浓度均无法满足10×Genomics单细胞测序的上机要求。因此，以香蕉幼根为材料，开发出一种原生质体制备方法，制备出高质量原生质体以应用于后续单细胞测序是本领域技术人员亟需解决的问题。

 

发明内容

本发明旨在提供一种香蕉幼根原生质体的解离方法，该方法简单高效，以解决现有技术制备出的原生质体质量和浓度均无法满足10×Genomics单细胞测序的上机要求的问题。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种香蕉幼根原生质体的解离方法，包括如下步骤：   

步骤一，采用组织培养技术获得香蕉组培苗，消毒清洗后切取香蕉幼根组织获得制备原生质体的实验材料；

步骤二，加入少量原生质体缓冲液使实验材料保持湿润，然后用刀片将香蕉幼根组织快速切成薄片，吸去所述原生质体缓冲液后加入酶解液，避光匀速摇晃酶解；

步骤三，采用细胞过滤器将步骤二所得的酶解液和原生质体混合液进行过滤，向滤液中加入原生质体缓冲液清洗，低温低速离心后去上清；

步骤四，加入原生质体缓冲液重新悬浮沉淀，用细胞过滤器再次过滤，低温低速离心后去上清；

步骤五，再次加入原生质体缓冲液重悬原生质体。

进一步地，所述步骤一中，香蕉组培苗为萌芽14天后的组培苗，消毒为用2%次氯酸钠消毒15 min；

消毒清洗后切取的幼根组织为从根尖起1 cm处切取的幼根组织。

进一步地，所述步骤二中原生质体缓冲液包括KCl 100 mM、MgCl2·6H2O 20 mM、CaCl2 20 mM、甘露醇0.6 M以及2-N-吗啉乙磺酸80 mM，溶剂为无菌水，pH值为5.5～5.8。

进一步地，所述步骤二中原生质体缓冲液的配制过程：称取0.75 g KCl、0.19 g MgCl2·6H2O、0.22 g CaCl2、0.22 g甘露醇以及1.76 g 2-N-吗啉乙磺酸溶于无菌水中，0.1 M Tris-HCl调整pH值为5.5～5.8，并以无菌水定容至100 mL，最后采用0.22 µm的微孔滤膜过滤灭菌。

进一步地，所述步骤二中酶解液的配制为将纤维素酶、离析酶、崩溃酶和BSA溶于原生质体缓冲液，待酶完全溶解后，采用0.1 M Tris-HCl调整pH值为5.5～5.8，以原生质体缓冲液定容至所需体积；按成分重量g：溶液体积mL计，所述纤维素酶、离析酶、崩溃酶和BSA的重量分别占到酶解液总体积的1%～3%、0.3%～1%、0.01 %～0.1%和0.1%；酶解液采用0.22 µm的微孔滤膜过滤灭菌。

进一步地，所述纤维素酶为纤维素酶R-10，所述离析酶为离析酶R-10。

进一步地，所述步骤二中将香蕉幼根组织快速切成0.9-1.1mm薄片；酶解反应条件包括反应温度为28～30℃，黑暗条件下将样品置于60～100 rpm/min的水平摇床上酶解1～3小时。

进一步地，所述步骤三中将步骤二获得的酶解液和原生质体混合液经70 μm细胞过滤器过滤，向滤液中加入原生质体缓冲液清洗，于4～8℃条件下以300～500 ×g离心力离心5～10 min后去上清。

进一步地，所述步骤四中，往步骤三获得的原生质体加入原生质体缓冲液重新悬浮沉淀，采用40 μm的细胞过滤器再次过滤，于4～8℃条件下以300～500 ×g离心力离心5～10 min后去上清获得原生质体沉淀。

进一步地，所述步骤五在重悬原生质体后，用FDA染色后用荧光倒置显微镜和血球计数板检测原生质体浓度和活率；染色时，FDA在混合液中的终浓度为100 μg/mL，黑暗条件下室温染色5-30 min。

基于上述技术方案，本发明具有以下优点：

本发明公开的香蕉幼根原生质体解离方法，实现了香蕉根原生质体的解离，操作简单，能够快速、高效地制备出原生质体，经最适酶浓度所分离得到的原生质体浓度可高达1.2×106个/ mL，活率高达92%，可以直接上机进行后续的10×Genomics单细胞测序，为探究香蕉根细胞基因表达及发育轨迹等研究打下基础，更为其他类型植物、其他部位的原生质体制备条件探索提供参考依据。

 

附图说明

图1为用于本发明实施例1的实验材料；

图2为采用本发明实施例4制备的香蕉幼根原生质体在20×光学显微镜下形态图；

图3为采用本发明实施例4制备的香蕉幼根原生质体在40×光学显微镜下形态图。

 

具体实施方式

为了更加清楚地理解本发明的技术方案，下面将结合附图说明和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述。需要说明的是，本文所述实施例是以本发明的技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于所述实施例。相反地，提供这些实施例的的目的是使本发明内容更加透彻全面。

本发明一实施方式提供了一种香蕉幼根原生质体的解离方法，包括如下步骤：步骤一，采用组织培养技术获得香蕉组培苗，消毒清洗后切取香蕉幼根组织获得制备原生质体的实验材料；步骤二，加入少量原生质体缓冲液使实验材料保持湿润，然后用刀片将香蕉幼根组织快速切成约1mm的薄片，吸去所述原生质体缓冲液后加入酶解液，避光匀速摇晃酶解1～3小时；步骤三，采用70 μm细胞过滤器将步骤二所得的酶解液和原生质体混合液进行过滤，向滤液中加入原生质体缓冲液清洗，低温低速离心后去上清；步骤四，加入原生质体缓冲液重新悬浮沉淀，用40 μm的细胞过滤器再次过滤，低温低速离心后去上清；步骤五，再次加入原生质体缓冲液重悬原生质体，FDA染色后用荧光倒置显微镜和血球计数板检测原生质体浓度和活率。

本发明实施例所使用实验试剂的配制具体如下：

原生质体缓冲液的配制：称取0.75 g KCl、0.19 g MgCl2·6H2O、0.22 g CaCl2、0.22 g甘露醇以及1.76 g 2-N-吗啉乙磺酸溶于无菌水中，0.1 M Tris-HCl调整pH值为5.5～5.8，并以无菌水定容至100 mL，最后采用0.22 µm的微孔滤膜过滤灭菌。

具体地，本发明提供的原生质体缓冲液包含KCl 100 mM、MgCl2·6H2O 20 mM和CaCl2 20 mM，所述KCl、MgCl2·6H2O和CaCl2具有保护细胞质膜的作用，使原生质体不受实验材料生理状态的限制，从而维持原生质体较好的生理状态。

具体地，本发明提供的原生质体缓冲液包含甘露醇0.6 M，所述甘露醇是一种在代谢上为惰性的渗透压稳定剂，可以维持缓冲液的渗透压，使解离后的原生质体维持较好的细胞形态和较高的细胞活力。

具体地，本发明提供的原生质体缓冲液包含2-N-吗啉乙磺酸80 mM，所述2-N-吗啉乙磺酸发挥稳定溶液pH值的作用。

酶解液的配制：称取纤维素酶R-10 1 g～3 g、离析酶R-10 0.3 g～1 g、崩溃酶10 mg～100 mg和BSA 0.1 g溶于原生质体缓冲液，待酶溶解完全后，采用0.1 M Tris-HCl调整pH值为5.5～5.8，并以原生质体缓冲液定容至100 mL，最后采用0.22 µm的微孔滤膜过滤灭菌。

按成分重量g：溶液体积mL计，具体地：

本发明提供的酶解液包含1%～3%的纤维素酶R-10、0.3%～1%的离析酶R-10以及0.01%～0.1%的崩溃酶，所述纤维素酶R-10、离析酶R-10和崩溃酶搭配能够有效、快速地分解香蕉幼根细胞壁，游离出原生质体；

本发明提供的酶解液包含0.1% BSA，所述BSA能提高酶解液中蛋白质的浓度，对酶起到保护作用，防止酶的分解和变性等。

不同酶含量的酶解液对香蕉幼根游离出原生质体的时间，以及原生质体的产量、活力均具有不同程度的影响。以下结合具体实施例详细说明。

实施例1

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 1 g、离析酶R-10 0.3 g、崩溃酶10 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例1的原生质体制备方法及其具体操作步骤如下：

1. 实验材料的选择：选取如图1所示萌芽14天的香蕉组培苗，用2%次氯酸钠消毒15 min，然后无菌水清洗6～8次后置于培养皿中，并用刀片从根尖起1 cm处切取幼根组织。
2. 原生质体的解离：将切取的香蕉幼根组织转移到新的无菌培养皿中，加入少量原生质体缓冲液使实验材料保持湿润，然后用刀片将香蕉幼根组织快速切成约1mm的薄片，吸去所述原生质体缓冲液后加入酶解液，黑暗条件下将样品置于60～100 rpm/min的水平摇床上酶解，摇床温度设置为28～30℃。
3. 原生质体的过滤与洗涤：将上述获得的酶解液和原生质体混合液经70 μm细胞过滤器过滤，向滤液中加入原生质体缓冲液清洗，于4～8℃条件下以300～500 ×g离心力离心5～10 min后去上清。
4. 再次加入原生质体缓冲液重新悬浮沉淀，采用40 μm的细胞过滤器再次过滤，于4～8℃条件下以300～500 ×g离心力离心5～10 min后去上清获得原生质体沉淀。
5. 原生质体的镜检和活力检测：将上述原生质体沉淀重悬在1 mL原生质体缓冲液中，吸取10 μL原生质体悬浮液与90 μL无菌水混合，即稀释10倍后滴加在载玻片上于20×、40×显微镜视野下观察原生质体形态；另吸取49 μL原生质体悬浮液和1 μL浓度为5 mg/mL的FDA母液混匀后于黑暗条件下室温染色5 min，然后加入PBS清洗，300～500 ×g离心力离心5～10 min后去上清，用1 mL PBS重悬原生质体并滴加在血球计数板上，用荧光倒置显微镜检测原生质体浓度和活率。

具体地，所述FDA是一种常用植物细胞原生质体活力鉴定染料，所述FDA母液的具体配置为称取5 mg FDA粉末溶于1 mL丙酮中，配成浓度为5 mg/mL的溶液，可置于4℃冰箱中避光保存备用，染色时将FDA母液与原生质体悬浮液混合，使其终浓度为100 μg/mL。

具体地，原生质体浓度(个/ml)＝(10×明场视野下5个大格内原生质体总数/5)×104×稀释倍数；

原生质体活率(%)＝荧光视野下5个大格内发绿光的原生质体数/明场视野下5个大格内原生质体总数。

采用实施例1的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例2

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 1 g、离析酶R-10 0.5 g、崩溃酶10 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例2的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例2的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例3

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 2 g、离析酶R-10 0.5 g、崩溃酶10 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例3的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例3的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例4

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 2 g、离析酶R-10 0.5 g、崩溃酶50 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例4的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例4的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例5

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 2 g、离析酶R-10 1 g、崩溃酶10 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例5的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例5的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例6

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 2 g、离析酶R-10 1 g、崩溃酶50 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例6的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例6的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例7

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 2 g、离析酶R-10 1 g、崩溃酶100 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例7的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例7的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例8

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 0.5 g、崩溃酶10 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例8的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例8的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例9

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 0.5 g、崩溃酶50 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例9的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例9的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例10

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 1 g、崩溃酶10 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例10的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例10的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例11

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 1 g、崩溃酶50 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例11的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例11的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例12

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 1 g、崩溃酶100 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例12的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例12的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例13

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 2 g、崩溃酶10 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例13的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例13的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例14

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 2 g、崩溃酶50 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例14的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例14的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

实施例15

按每100 mL酶解液含纤维素酶R-10 3 g、离析酶R-10 2 g、崩溃酶100 mg和BSA 0.1 g的比例参考“酶解液的配制”步骤配制酶解液。

实施例15的原生质体制备方法参考实施例1，采用实施例15的原生质体酶解时间、原生质体产量及原生质体活率如表1 所示。

表1为实施例1-15不同酶浓度条件下香蕉幼根原生质体的提取结果。

表1

	纤维素酶R-10	离析酶 R-10	崩溃酶	酶解时间	原生质体产量（个/mL）	原生质体活率（%）
实施例1	1%	0.3%	0.01%	3h	1.4×105	89
实施例2	1%	0.5%	0.01%	3h	1.6×105	89
实施例3	2%	0.5%	0.01%	2.5h	2.1×105	90
实施例4	2%	0.5%	0.05%	2h	1.2×106	92
实施例5	2%	1%	0.01%	2.5h	2.3×105	90
实施例6	2%	1%	0.05%	2h	1.1×106	91
实施例7	2%	1%	0.1%	1h	1.1×106	92
实施例8	3%	0.5%	0.01%	2.5h	1.7×105	88
实施例9	3%	0.5%	0.05%	2.5h	2.7×105	85
实施例10	3%	1%	0.01%	2.5h	1.3×105	80
实施例11	3%	1%	0.05%	2.5h	1.6×105	84
实施例12	3%	1%	0.1%	1h	2.5×105	85
实施例13	3%	2%	0.01%	2.5h	2.9×104	75
实施例14	3%	2%	0.05%	2.5h	3.6×104	79
实施例15	3%	2%	0.1%	1h	5.7×104	80

基于上述结果，按成分重量g：溶液体积mL计，采用含2％ 纤维素酶R-10、0.5％ 离析酶R-10和0.05% 崩溃酶的酶解液所获原生质体数量最多、形态最佳、背景干净，酶解时间适宜；同时在获得同等水平原生质体的酶组合中所含各酶浓度最低，故本发明采用含2％ 纤维素酶R-10、0.5％ 离析酶R-10和0.05% 崩溃酶的酶解液制备香蕉幼根单细胞悬液，用于后续的10×Genomics单细胞测序上机实验。

取使用该酶解液所提取的原生质体悬浮液于光学电子显微镜下进行镜检观察，结果如图2、图3所示。可见所得的原生质体结构清晰，形态完整。

本发明公开的香蕉幼根原生质体解离方法，实现了香蕉根原生质体的解离，操作简单，能够快速、高效地制备出原生质体，经最适宜酶浓度组合酶解液所分离得到的原生质体数量多、形态佳，酶解时间适宜，可直接进行后续的10×Genomics单细胞测序上机实验，为探究香蕉根细胞基因表达及发育轨迹等研究打下基础，更为其他类型植物、其他部位的原生质体制备条件探索提供参考依据。

最后应当说明的是:对于本领域的技术人员来说，可以根据以上实施例的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

图1 

图2 图3