元信生物
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单细胞免疫组库测序

技术原理图：

10×Genomic单细胞免疫组库测序是建立在GemCode技术上的微流体平台，将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中；接下来在每个油滴内，凝胶珠溶解，细胞裂解释放mRNA，通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA。液体油层破坏后，cDNA一分为二，后续同时进行基因表达和免疫组库文库构建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通过设计在TCR或者BCR的C区域的巢式PCR引物进行富集。然后使用Illumina测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据，实现在单细胞水平同时对基因表达和免疫组库进行研究。

图1 | V(D)J重组产生TCR/BCR多样性

图2 | 10×Genomics单细胞免疫组库实验原理

操作流程：

利用10×Genomics平台完成单细胞的分离、反转录成cDNA后，选择不同的研究目的进行文库构建：5’端基因表达文库、TCR的V(D)J文库或和BCR的V(D)J文库。将cDNA分成2份或3份同时进行TCR/BCR的V(D)J富集、文库构建、测序和5’端单细胞转录组文库构建、测序，获得每个细胞表达谱和V(D)J全长序列，获得数据进行细胞亚群聚类、细胞表达特征和标记分子筛选等分析。

图3 | 5’单细胞表达谱和V(D)J免疫组库实验流程

图4 | 5’单细胞表达谱和V(D)J免疫组文库的比较

表1 | 5’单细胞表达谱和V(D)J免疫组文库及测序参数

 

分析内容：

1、测序数据质量控制；

2、比对与注释：样本基本信息结果统计，样本contig注释信息结果统计，样本Consensus序列注释信息结果统计；

3、Clonotype分型；

4、特征分析：CDR3特征分析，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；

5、多样本分析：样本间Clonotype比较，Overlapping Clonotype聚类分析，Overlapping Clonotype差异分析。

技术优势:

  1. 可实现成对的重链和轻链（B细胞）或α和β链（T细胞）的全长测序
  2. 精确到单细胞水平，能获得大量单细胞的免疫组数据
  3. 大规模单细胞VDJ+表达谱测序，单个细胞成本大大降低

应用领域:

免疫组库在肿瘤方面的应用

肿瘤细胞是具有免疫原性的，会引起T淋巴细胞浸润到肿瘤组织中，即浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes, TIL），多项研究表明肿瘤组织中TIL的存在及数量与病人生存期相关，因此TIL也许可作为一种肿瘤预后的生物标记物。免疫组库技术已用于多种肿瘤类型的TIL研究，例如结直肠癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤。此外，免疫组库可以捕捉肿瘤发生时免疫微环境的变化，寻找免疫治疗的靶点，从而辅助免疫治疗更好的抗击肿瘤。

免疫组库在移植和免疫重建上的应用

器官或者骨髓移植时，经常会诱发宿主排斥反应的发生，从而发生慢性移植抗宿主病。同种异体反应，被随机分布在整个T细胞组库的交叉反应，因此延迟T细胞恢复和限制的T细胞受体多样性与异体移植后感染和疾病复发的风险增加相关。免疫组库测序技术可以检测移植后T细胞库，进行从而识别移植后感染或者复发的高危人群。

免疫组库在自身免疫性疾病方面的应用

自身免疫免疫性疾病是由于机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。因此，利用免疫组库技术可分析异常表达的免疫细胞（T细胞或抗体），作为临床诊断的标志物。寻找优于现有标准的生物标记物、研究免疫系统在自身免疫中的机制，从而为疾病的诊疗提供依据。

免疫组库在其他方面的应用

免疫组库在感染性疾病、抗体开发、用药及疫苗评估等多个方面均有应用价值。例如通过免疫组库研究，可以检测感染类疾病过程中的免疫动态变化；在抗体开发方面，可以获得特征性的BCR（Ig）序列，缩短抗体开发的流程；也可以针对某种疾病用药后的外周血样本进行评估，确认药物是否激发免疫反应及其功效。

样本要求:

◆ 样品类型：新鲜人或小鼠细胞悬液、血液（全血、PBMC等）；

◆ 细胞来源：血液提取、磁珠富集、流式分选、组织解离；

◆ 细胞大小：小于40um；

◆ 细胞总量：细胞悬液，一个样本细胞起始量约2.0x105个。

◆ 质量要求：细胞活性大于85%，理想浓度约为1000个/ul。

◆ 细胞培养基及缓冲液不能含有Ca2+和Mg2+等影响酶活性的物质。

应用案例文章：

Distinct microbial and immune niches of the human colon

bioRxiv preprint first posted online: James KR at el. Dec. 12, 2019, doi:http://dx.doi.org/10.1101/2019.12.12.871657

胃肠道菌群和免疫细胞紧密相互作用并表现出区域特异性，但人们对这些互作关系如何随人体部位的不同是否存在差异的了解太少。研究者同时评估了健康人群结肠中的菌群和单个免疫细胞，在肠系膜淋巴结中具有免疫细胞的配对特征，以描绘稳态时结肠的免疫生态。研究者描述了沿着结肠的独特的辅助T细胞激活和迁移情况，并描述在淋巴组织和结肠中调节T细胞的转录适应轨迹。最后，结果显示出从盲肠到乙状结肠的B细胞积累，克隆扩增和突变频率不断增加，并将其与越来越多的活性细菌种类联系起来。

Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment

CELL影响因子: 30.41 Elham Azizi at el. 23 August 2018, Pages 1293-1308. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.05.060

了解肿瘤微环境中免疫细胞的表型，对于癌症进展和免疫治疗反应的研究至关重要。研究者使用单细胞RNA测序分析了来自8位原发性乳腺癌患者的45,000个免疫细胞，同时也添加了正常乳腺组织、血液和淋巴结中的免疫细胞作对照。研究中观察到正常免疫细胞与肿瘤组织中免疫细胞之间有显著相似性，但后者针对肿瘤微环境出现特异性连续表型扩展。对来自另外27,000个T细胞的成对单细胞RNA和T细胞受体（TCR）测序，结果揭示了TCR组合使用对表型多样性的影响。